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益生菌发酵豆乳对提高结合态大豆异黄酮转化的效果
大豆富含维生素、异黄酮、蛋白质、膳食纤维及不饱和脂肪酸等营养物质，是人类主要的植物蛋白来源之一 [1] 。豆乳是大豆经过加工后获得的一种饮料，因其具有独特的风味、营养物质丰富且易吸收而深受大众喜欢。对于营养不良的人群以及牛奶供应不足的人群来说，豆乳蛋白的营养价值高且更容易被人体吸收[2]。益生菌为一类对机体有益的活性微生物，可以平衡机体肠道内菌群，同时也可以产生活性物质，促进人体健康[3]。乳酸菌是一类存在于人体胃肠道中的多效益生菌，可以降低胆固醇水平，具有抵抗低酸碱度和高胆盐的能力，研究价值非常高[4]。发酵豆乳由灭菌豆乳经过益生菌发酵而形成，其具有豆香味，保留了豆乳原有营养价值的同时减少了高脂饮食引起的高脂血症和肝损伤[5]，可改善低聚糖的消化率[6-7]，同时减少草酸、植酸、蛋白酶抑制剂、脲酶等抗营养成分[8-9]。此外，通过益生菌的发酵，可将结合型的大豆异黄酮转化为更易被人体消化吸收的游离型大豆异黄酮[10-11]。大豆异黄酮被称为天然植物雌激素，虽然对机体健康有益，但主要是以结合态的大豆异黄酮存在，即为糖苷形式，难以被人体消化吸收[12]。当人体摄入含有大豆异黄酮的食物后，游离型的大豆异黄酮可直接在小肠被吸收，而结合型的大豆异黄酮则在肠道中被 β-葡
萄糖苷酶水解，转化成游离型的苷元从而被机体消化吸收，因此游离型的大豆异黄酮消化吸收率更高[13]。同时其在预防骨质疏松、心血管疾病、神经保护和抗肿瘤等疾病方面有一定的生理功效。并且大豆异黄酮苷元具有较高的市场价格，因此提高豆类食品中苷元类物质的含量，增加大豆异黄酮资源的利用度，对保健食品的开发具有重要意义。
本实验为探究益生菌在全豆乳发酵中对结合态大豆异黄酮的转化，以干酪乳杆菌 (Lacticaseibacilluscasei) 、嗜酸菌 乳 杆 菌 ) (Lactobacillusacidophilus) 、 植 物 乳 杆 菌(Lactobacillusplantarum) 分别发酵全豆乳，以发酵豆乳的H pH 值降到 5 4.5 为发酵终点，测定发酵期间 H pH 值、滴定酸度、活菌数、表观黏度、游离氨基氮和大豆异黄酮含量的变化，并对发酵产品进行感官评价，为益生菌发酵豆乳的研究提供科学依 据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 材料与试剂 干酪乳杆菌 (Lacticaseibacilluscasei)CICC23488 、植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)CICC22696 ，中国工业微生物 菌 种 保 藏 管 理 中 心 ； 嗜 酸 乳 杆 菌(Lactobacillusacidophilus)BNCC185342 ，北纳创联生物技术研究院；S MRS 肉汤、S MRS 固体培养基，北京奥博星生物技
术有限责任公司；乙腈、甲醇和甲酸均为色谱纯，天津市大茂化学试剂厂；大豆苷、大豆苷元、染料木苷和染料木素标准品均 为 HPLC 级，西安晶博生物科技有限公司，含量 ≧98% 。实验所有水均为由 Q-Grad® 超纯水系统制备的超纯水(18.2MΩ) ； 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 及 以 上 级 别 ，Sigma-Aldrich。
全豆乳产品，陕西秦豆园农业科技有限公司生产并提供。
1.1.2 仪器设备 S HWS 智 能 型 恒 温 恒 湿 培 养 箱 ， 宁 波 江 南 仪 器 厂 ；HaierBCD- - 206T 冰 箱 ， 青 岛 海 尔 股 份 有 限 公 司 ；H VisionPluspH6178pH 剂，安徽赛科环保科技有限公司；N YUEJIN 超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司； SHIMADZU高效液相色谱，岛津企业管理( ( 中国) ) 有限公司； TGL- - 16gR高速离心机，上海安亭科学仪器厂； KQ- -B 250DB 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司； BROOKFIELDDV- -E E 型黏度计，上海一恒科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。
1.2 试验方法 1.2.1 菌株活化与菌悬液制备 将- - 80℃ 保存的 L.casei、 、s L.acidophilus 和 和 m L.plantarum 分在 别培养在 S MRS 肉汤培养基中， 37℃ ， 12h 。为了确保益生菌生长活力达到良好的状态，按照活化培养液体积分数为 3%
的接种量连续传代 3 次。每次使用前各菌株均在 MRS 肉汤培养基中活化 2 代。以上操作均在超净工作台中完成。取 10mL活化培养的种子液制成 108CFU/mL 菌悬液。
1.2.2 全豆乳的制作工艺 选料筛选(精选非转基因大豆，颗粒饱满)→浸泡、煮豆→制浆→均质→罐装→杀菌(超高温、短时连续杀菌)→冷却→4℃保藏 1.2.3 发酵全豆乳的制备 取 L 300mL 按 2 1.2.2 制作的全豆乳平均分装于 3 3 个无菌锥形瓶照 中，按照 3%( 体积分数，下同) )将 接种量分别将 L.casei 、s L.acidophilus 和 和 m L.plantarum 接种于分装的全豆乳中，用无菌玻璃棒搅拌均匀， 37℃ 条件下发酵至终点，将发酵好的全豆乳于 4℃ 冷藏备用。
1.2.4 益生菌在全豆乳中的发酵特性及活性物质的含量变化 取 取 L 300mL 全豆乳平均分装于 3 3 个无菌锥形瓶中，以 3% 接种量分别将 L.casei 、s L.acidophilus 和 和 m L.plantarum 接种于分， 装的全豆乳中，用无菌玻璃棒搅拌均匀， 37℃ 恒温恒湿培养，每隔 h 2h 取样测定其 H pH 值、滴定酸度、表观黏度直至发酵结束 (pH4.5) ，测定发酵豆乳活菌数、游离氨基氮、大豆异黄酮含量。
1.2.4.1 主要理化指标的测定 水分的测定参考 GB5009.3 —2 2022 《食品安全国家标准食品中
水分的测定》，以直接干燥法进行测定；灰分的测定参考GB5009.4 — 2022 《食品安全国家标准食品中灰分的测定》，以 灼 烧 重 量 法 进 行 测 定 ； 脂 肪 含 量 的 测 定 参 考GB5009.6 — 2022 《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》，以 索 氏 抽 提 法 进 行 测 定 ； 蛋 白 质 含 量 的 测 定 参 考GB5009.5 —2 2022 《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》，以凯氏定氮法进行测定。
H pH 值用 H pH 计在室温下检测；滴定酸度：准确称取发酵全豆乳样品 g 5g 于 于 L 100mL 锥形瓶中，加入 L 40mL 超纯水，用玻璃棒搅拌均匀，加入 2 2 ～3 3 滴酚 酞指示剂，用 H 0.1mol/LNaOH 溶液且 滴定至微红色且 s 30s 内颜色不消失。滴定酸度(吉尔涅尔度°T)为 100mL 发酵豆乳消耗 0.1mol/LNaOH 的体积(mL)。消耗 1mL0.1mol/LNaOH 相当于 1°T。
表观黏度使用 BROOKFIELDDV- -E E 型黏度计测定发酵全豆乳黏考 度；游离氨基氮参考 H CHURCH 等 [14] 的方法，用邻苯二甲醛衍生比色法测定。
1.2.4.2 活菌计数 取一定量的发酵全豆乳，用无菌水进行梯度稀释，然后选取稀释 10- -5 5 、 10- -6 6 、 10- -7 7 倍的发酵全豆乳用平板倾注法测定活菌数。37℃倒置培养 24～48h，记录菌落总数，用 CFU/mL表示。
1.2.4.3 感官评定
参照文献 [15] 的方法，邀请从事食品研究的人员男女各 5 5 名味 进行感官评定，每次品尝需在口中细细品味 s 5s 以上并用舌头搅动发酵全豆乳。分别从组织状态、气味、口感和质地打分，每次品尝前需充分漱口，评分标准见表 1。
表 1 感官评分表 Table1Sensoryevaluationstandard 1.2.4.4 发酵豆乳中大豆异黄酮含量的测定 参照 GB/T23788 — 2022 《保健食品中大豆异黄酮的测定方法高效液相色谱法》。
样品预处理：取发酵豆乳 L 5mL 于 于 L 50mL 容量瓶，加入 80%( 体积分数，下同) ) 甲醇溶液至接近刻度线，然后以 W 100W 功率超荡 声振荡 40min 。超声结束后用 80%甲醇定容，摇匀。取适量样品溶液以 8160r/min 离心 15min。将上清液过 0.45μm 滤膜后备用。
HPLC：
色谱条件：色谱柱：
ZORBAXSB- - C18 色谱柱 (4.6mm×250mm ，5μm) ；流动相 A A ：乙腈；流动相 B B ：
0.5% 甲酸超纯水。流速1mL/min；波长 260nm；进样量 20μL；柱温 30℃。梯度洗脱程序见表 2。
表 2 梯度洗脱程序 Table2Gradientelutionprocedures 1.2.5 数据分析 所有实验至少重复 3 3 次，结果以 “ 平均值 ±SD” 表示。采用
SPSS15.0 软件对实验数据进行统计学分析，Origin7.0 软件绘图。文中上标字母不同表示存在显著性差异(P0.05)。
2 结果与分析 2.1 全豆乳主要理化指标的测定结果 本实验制备的全豆乳水分含量为 81.49% ，灰分、脂肪和蛋白质含量分别为 1.15% 、 2.78%和 和 4.35% 。
2.2 三株益生菌对全豆乳的发酵特性 2.2.1 全豆乳发酵过程中 pH 值的变化 分别以 L.casei 、 L.acs idophilus 和 和 m L.plantarum 发酵全豆乳，每隔 h 2h 测定发酵期间的 H pH 值至发酵终点，结果如图 1 1所示。
图 1 三株益生菌发酵全豆乳 pH 值的变化 Fig.1ChangesinpHvalueofwholesoymilkfermentedbythreeprobiotics i L.casei 和 和 m L.plantarum 发酵全豆乳 H pH 值下降的速度较快，而 L.acidophilus 发酵全豆乳在0 0 ～ 7h 时 pH， 值下降缓慢，7 7 ～h 14h 时呈快速下降趋势。其中，L.casei 发酵全豆乳到达终点(pH4.5)用时最短，为 7h；而 L.acidophilus 发酵全豆乳到达终点用时最长，为 20h，这可能是由于其蛋白水解能力较弱造成的。CHURCH 等[14]用单一益生菌发酵豆乳，结果显示达到发酵终点用时较长，与本研究所得结论基本一致。
2.2.2 全豆乳发酵过程中滴定酸度值的变化
由图 2 2 可知，s L.acidophilus 发酵全豆乳在 0 0 ～h 6h 时滴定酸度值变化缓慢，然后呈现快速上升趋势。L.plantarum 发酵全豆乳在发酵结束时滴定酸度值最高，为 66.17°T，与L.acidophilus 发酵全豆乳滴定酸度值没有显著差异。而L.casei 发酵全豆乳在发酵结束时滴定酸度值显著低于其他益生菌发酵的样品(P0.05)，为 32.83°T。
图 2 三株益生菌发酵全豆乳滴定酸度值的变化 Fig.2Changesintitrationacidityofwholesoymilkfermentedbythreeprobiotics 2.2.3 全豆乳发酵过程中表观黏度的变化 分别以 L.casei 、s L.acidophilus 和 和 m L.plantarum 发酵全豆乳，每隔 h 2h 测定发酵期间的黏度值至发酵终点，结果如图 3 3所示。
图 3 三株益生菌发酵全豆乳黏度的变化 Fig.3Changesinviscosityofwholesoymilkfermentedbythreeprobiotics 3 3 株益生菌发酵全豆乳黏度呈现快速上升趋势，发酵结束时均在 1.0 ～ 1.4Pa·s ，其中 i L.casei 发酵全豆乳黏度略微高于其他益生菌，为 1.397Pa·s 。L.casei 发酵全豆乳表观黏度在短时间内快速上升，这可能是由于益生菌的快速增殖使得乳酸含量升高，大豆蛋白凝固形成酸凝胶，导致黏度迅速增加[16]。其他 2 种菌发酵全豆乳的表观黏度变化比较平缓，
这与它们较长的发酵时间相吻合，表明这 2 种菌增殖速度相对较慢，相应的乳酸含量增加也较慢，表观黏度也因此呈现平缓上升的趋势。
2.2.4 全豆乳发酵起始和结束时的活菌数 发酵乳制品中活菌数须在 106CFU/mL 以上且能在肠道中存活才能发挥其益生特性 [17] 。由表 3 可知，发酵结束时，3 株益生菌发酵全豆乳活菌数均显著升高(P0.05)，均 108CFU/mL。其中，L.casei 发酵全豆乳到达发酵终点时活菌数最高为2.03×109CFU/mL。这可能是因为发酵过程中会产生一些碳源如水苏糖、棉子糖、蔗糖、葡萄糖等，这些物质可作为发酵菌的能量来源，加速了发酵菌的生长增殖。
表 3 发酵起始和结束时的活菌数单位：lgCFU/mL Table3Numberofviablebacteriaatthebeginningandtheendoffermentation 注：同行中不同字母表示差异显著(P0.05) 2.2.5 全豆乳发酵过程中游离氨基氮的变化 分别以 L.casei 、s L.acidophilus 和 和 m L.plantarum 发酵全豆乳，测定发酵结束时的游离氨基氮的含量，结果如图4 4 所示。发酵结束时，L.acidophilus 的蛋白质水解能力最强，其发酵结束时游离氨基氮的含量为 3.09mmol/L。而 L.casei 的蛋白质水解能力较其他 2 株菌弱，发酵结束时游离氨基氮的含量为 2.39mmol/L。其可能原因是发酵时间越长，全豆乳中大
豆蛋白水解越彻底。菌株的类型和发酵时间可能影响蛋白水解的活性[18]。此结论与本研究结果基本一致。
图 4 三株益生菌发酵全豆乳游离氨基氮的变化 Fig.4Changesoffreeaminonitrogeninwholesoymilkfermentedbythreeprobiotics 2.2.6 感官评定 图 图 5 5 为发酵结束后于 4℃ 冰箱贮藏 h 12h 后全豆乳的感官 评价结果。由图 5 可知，L.casei 发酵全豆乳感官评分最高，L.plantarum 次之，L.acidophilus 最低。L.casei 发酵全豆乳具有外观光滑紧致、色泽柔和、产品形状保持较好的特点。虽有少量乳清析出，但酸甜比例适宜、口感细腻、无豆腥味、味道可口，符合大众口味。因此，L.casei 更适合发酵有良好口感的豆乳，开发出畅销大众的新产品。
图 5 三株益生菌发酵全豆乳感官评分 Fig.5Sensoryscoresofwholesoymilkfermentedbythreeprobiotics 2.3 三株益生菌发酵全豆乳中大豆异黄酮的含量 2.3.1 原全豆乳中大豆异黄酮含量的测定 大豆异黄酮类物质中主要包括大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素等活性成分。通过益生菌发酵将大豆中糖苷形式的大豆异黄酮转化为苷元形式的大豆异黄酮，可极大增加其消化吸收率。
如图 6 6 所示，原全豆乳主要含大豆苷和染料木苷，含量分别为 为 67.30 、 104.6μg/mL ，苷元和染料木素的含量较少，分别为 为 3.13 、 2.43μg/mL 。这与大豆异黄酮中，苷元占 2%～3%，糖苷占 97%～98%的结果一致[12]。
图 6 原全豆乳中大豆异黄酮含量 Fig.6Soyisoflavonecontentinoriginalwholesoymilk 2.3.2 大豆苷和大豆苷元在全豆乳发酵期间的变化 由图 7 7- -a a 可知，i L.casei 和 和 s L.acidophilus 发酵全豆乳中大豆苷含量在发酵结束时显著下降 (P0.05)， ，m L.plantarum 发酵全豆乳中大豆苷含量在发酵前后没有显著差异 (P0.05) 。而图 7-b 显示 3 株...
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