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结合高通量方法揭示了皮肤和血液环境驱动的信号，并定义了Sézary 综合征中的肿瘤异质性
抽象 Sézary 综合征（SS）是皮肤 T 细胞淋巴瘤的侵袭性变体，其特征在于肿瘤性 CD4 +淋巴细胞（SS 细胞）的积累，主要在血液，淋巴结和皮肤中。SS 的肿瘤扩散模式使这种淋巴瘤成为一种独特的疾病模型，允许同时进行血液和皮肤采样以进行分析。本综述总结了最近的研究，突出了由 SS 细胞和血液皮肤微环境之间的串扰引发的转录程序。新兴数据证明，皮肤来源的 SS 细胞始终表现出更高的活化/增殖率，这主要是由 T 细胞受体信号传导相对于匹配的血液 SS 细胞驱动的，这些 SS 细胞看起来是静止的。生化分析还表明，与配对的血液对应物相比，皮肤 SS 细胞中 PI3K / AKT / mTOR 的过度活化，PI3K / AKT / mTOR 是目前临床试验中的多种抑制剂的靶向途径。这些结果表明，活性和静止的 SS 细胞在该淋巴瘤中共存，并且可以分别用不同的治疗方法治疗。最后，本综述强调了循环 SS 细胞异质性的最新发现，突出了一系列可以改善诊断的新标志物，这些标志物代表了新的治疗靶点（GPR15，PTPN13，KLRB1 和 ITGB1）以及能够对 SS 患者进行疾病侵袭性分层的新遗传标记（PD-1 和 CD39）。
关键字：
皮肤 T 细胞淋巴瘤; 塞扎里综合征; 血液和皮肤微环境; 单细胞分析; 转录组; 生化信号; 免疫表型; 异质性 1. 引言 皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCLs）
包括大范围的成熟 T 细胞肿瘤，其特征是肿瘤性 CD4+ T 淋巴细胞在皮肤中积聚。
CTCL 最常见的亚型是蕈样肉芽肿（MF），占 CTCL 病例的 60%，而更罕见的变异是 Sézary 综合征（SS），约占 5%[1]。大多数早期 MF 患者表现为恶性细胞皮肤受限浸润和惰性病程[1]，但约 15%的患者可进展至以肿瘤和红皮病为特征的晚期阶段，且在不到 5 年时存活率下降[2，3]。相反，SS 是 CTCL 的一种罕见的白血病亚型，从一开始就显示主要存在于血液、淋巴结和皮肤中的肿瘤性淋巴细胞。
MF 和 SS 之间的关系仍然存在争议。长期以来，SS 被认为是 MF 的侵袭性形式，但来自基因组分析的越来越多的数据表明，MF 中发生了特异性染色体改变，但 SS 中没有，反之亦然，这表明它们是两个独立的临床实体[4]。这些发现也通过 MF 和SS 表达的不同转录组谱和细胞表面标记物得到加强。根据这些数据，Campbell 等人指出，MFs 起源于皮肤居民效应记忆（EM）T 细胞，而 SS 起源于中枢记忆（CM）T 淋巴细胞[5]。然而，SS 和 MF 的起源细胞仍未确定。
尽管在表征SS发病机制方面付出了巨大努力，但它仍然是一种无法治愈的疾病，IVA期的5年总生存率（OS）为15%-40%，IVB 期为 0%-15%[2，6]。迄今为止，大多数研究已经探索了 SS 的内在分子特征，证明它的特点是染色体畸变的复杂特征[7，8，9]和广泛的基因，这些基因受到体细胞拷贝数改变和体细胞单核苷酸变体的不同影响，这些变异主要参与 T 细胞活化和凋亡，NF-kB 的活化，JAK / STAT 信号传导， 染色质重塑和 DNA 损伤反应[10，11]。
最近，人们的注意力已经转移到影响癌症病理生理学的外在机制上。事实上，了解肿瘤微环境如何维持肿瘤细胞已成为癌症研究的焦点[12]。关于 CTCL，许多报告已经描述了恶性淋巴细胞与皮肤元素之间复杂的细胞相互作用，这些相互作用在 CTCL发病机制中起关键作用[13 ，14，15，16，17]。
与转移性播散不同，皮肤淋巴瘤的播散并不反映肿瘤进展，而是肿瘤性淋巴细胞的保守生理行为[18]。该特征表明这些细胞对皮肤生态位的强烈依赖性，皮肤生态位通过释放营养物质和诱导细胞信号来支持其增殖和存活[19，20 ，21，22，23]。肿瘤是一种动态疾病，在其进展过程中通常会获得更大的异质性。这意味着原始癌细胞获得不同的分子特征，产生肿瘤内的异质性。这种情况是癌症治疗失败的最大原因，因为癌细胞中的空间和时间遗传和表观遗传多样性和/或可塑性基因表达通常与耐药机制有关[24]。肿瘤微环境也对异质性做出了很大贡献，它触发了肿瘤细胞的独特和特异性信号。最后一个方面在 CTCL 中特别重要，因为 SS 细胞同时侵入血液和皮肤区域，在那里它们与角质形成细胞以及旁观者基质细胞和免疫细胞相互作用[25]。流体和固体环境对肿瘤细胞的影响增加了疾病的复杂性，并产生了肿瘤内的异质性。
为了提供与 CTCL 中发现的分子异质性和去调节途径的最新综述相比的新视角[26，27]，我们在这里专注于 SS 细胞配对皮肤和血液样本之间的比较分析。新兴数据描述了在这两个 SS 细胞亚群中触发的分子信号。还特别强调了对在血液衍生的 SS细胞中发现的转录异质性的新见解，突出了可以改善这种侵袭性 CTCL 形式的诊断和预后的新标志物。
2. 血液和皮肤微环境驱动 SS 细胞的转录程序和信号传导 皮肤微环境在 SS 发病机制中的作用长期以来一直被假设，但其在体内的功能知之甚少。最近，一些研究分析了匹配的血液和皮肤来源的 SS 细胞，揭示了这两个细胞亚群之间的实质性差异。在本节中，我们将讨论到目前为止获得的主要结果（图 图1）。
图 图 1.从配对的皮肤和血液来源的 SS 细胞之间的比较中产生的分子信号。在配对的皮肤和血液来源的 SS 细胞之间进行的比较分析突出了在这两个 SS 细胞亚群中触发的分子信号。
Roelens 等人是第一个研究这一方面的作者[28]。在一项针对 16 名 SS 患者的研究中，他们观察到与血液 SS 细胞相比，匹配的皮肤 SS 细胞显示出更活化的表型，白细胞介素受体（如 CD25（IL-2R），CD215（IL-15R）和 CD127（IL-7R））的表达失调，这表明皮肤 SS 细胞具有主要的增殖和生存优势，响应于参与 SS 发病机制的特定白细胞介素。这些作者证明，皮肤SS 细胞也显示出更高的趋化因子受体（如 CXCR3、CCR6 和 CCR10）的表达，而 CCR4 导致下调，这一发现可以解释治疗性抗 CCR4 单克隆抗体莫加木珠单抗在皮肤水平上的疗效较低[29]。
单细胞方法的最新发展允许以前所未有的分辨率分析单个癌细胞的转录组，细胞表面标志物和基因组。例如，Herrera 等人[30]最近采用了一种多模式方法，可以检测 T 细胞受体（TCR）克隆性（TCR β CD3）、单细胞转录组和表面蛋白表达，以及基于拷贝数变异（CNVs）的遗传分析，这些分析来自 5 名 SS 患者的匹配皮肤和血液样本[30]].作者证明，匹配的皮肤和血液来源的 SS 细胞具有相同的 TCR 克隆型，证明相同的肿瘤性淋巴细胞可以分布在两种肿瘤环境中。转录分析强调，血液 SS 细胞包含几个以不同表达谱（高转录异质性）为特征的簇，而皮肤来源的 SS 细胞主要聚集在一起，揭示了更均匀的表达谱（低转录异质性）（图 图 2）。系统发育分析表明，SS 细胞在皮肤和血液之间是连续迁移的，而不是针对疾病起源组织预测的单向迁移[30]。
图 图 2.塞扎里细胞的肿瘤内异质性。皮肤和血液来源的 SS 细胞在增殖能力，活化标志物的表达和转录异质性水平方面表现出差异。血 SS 细胞表现出表型异质性，在特定培养条件和 PDX 小鼠模型中也进行了评估。
因此，在血液和皮肤来源的 SS 细胞中发现的高转录质性和低转录异质性可能是由 SS 细胞的重编程引起的，因为它们从一个肿瘤环境传递到另一个肿瘤环境。例如，从血液，它们克服血流动力学力并与血细胞相互作用，到皮肤，它们与基质和免疫细胞相互作用，反之亦然。通过进行转录组比较，作者还证明皮肤 SS 细胞与更活化的表型相关，具有由 T 细胞活化，TCR连接和有丝分裂原诱导的几种转录因子的强烈上调，包括细胞周期的调节因子（图 图 1）。其中，皮肤 SS 细胞的活化状态与 PD-1的持续上调有关，并且比在成对循环细胞中观察到的增殖能力更大，Cristofoletti 等人也证明了这一点[31]。相反，血液 SS 细胞的静止状态与 KLF2，TCF7 和 CD62L 过表达有关，与它们在 T 细胞静息中的作用一致[32，33，34]（图 图 1）。应该注意的是，PD-1 是一种抑制性受体，在 T 细胞活化后上调，目的是避免细胞过度激活的损害，从而承担耗尽作用[35]。因此，与成对的血液 SS 细胞相比，皮肤 SS 细胞中发现的 PD-1 过表达似乎反映了它们的活化状态[30]。
总体而言，这些在配对的皮肤 - 血液 SS 细胞上进行的实验揭示了哪些分子驱动程序需要排列 SS 细胞的组织分布。它们还表明有可能使用同时或按顺序施用的药物，这些药物能够干扰静息的血液 SS 细胞和增殖的皮肤 SS 对应物。
3. 皮肤 SS 细胞与匹配的血液对应物相比表现出过度激活的 PI3K / AKT / mTOR 信号传导：聚焦皮肤微环境 在 TCR 和共刺激受体接合时 CD4+T 细胞的活化导致表达谱改变、T 细胞蛋白质组的重塑以及分化为效应 CD4+T 细胞亚群[36]。在 SS 中经常观察到 TCR 通路改变[7，9，37，38，39，40]。TCR 的参与激活了 PI3K/AKT/mTOR 途径等，导致 T 细胞增殖、存活和分化以及细胞因子的产生[41]。
多年来，许多研究证明 PI3K/AKT/mTOR 信号传导与 SS 发病机制密切相关。早期的基因组研究表明，PTEN 是PI3K/AKT 信号传导的主要拮抗剂[42]，在 MF [43]和 SS 中均在单 allelic 水平上经常缺失，其中 MIR-21、miR-106b 和 miR-486也下调了 PTEN[44]。最近，我们的研究调查了 43 名 SS 患者中属于该级联的成员的 CNV，突出了复发性改变;即，LKB1（48%），PTEN（39%）和 PDCD4（35%）等肿瘤抑制因子的损失，以及原癌基因 P70S6K（30%）的升高。这些 CNV 中的每一种，无论是单独评估还是联合评估，都与 SS 患者的生存率降低有关[31]。值得注意的是，这些遗传改变在患者中的分布不同，从而导致患者间异质性。
根据这些结果，发现 PI3K/mTOR 抑制剂的治疗效果在患者中是可变的，并且与它们的基因组状态相关，从而证实了异质性对 SS 患者临床过程的强烈影响[45]。
功能实验表明，在 SS 皮肤病变中检测到的许多细胞因子和生长因子能够激活 PI3K / AKT / mTOR 信号传导。第一个证据来自 Marzec M.等人[46]，他们证明 IL-2 在活化的原代 SS 细胞中触发了这一途径，并且通过 mTORC1 抑制剂雷帕霉素[46，47]治疗获得的抑制作用能够在体外阻断 SS 细胞生长[46]以及在异种移植 T 细胞淋巴瘤小鼠模型中[48]。
在这方面已经进行了其他研究：Murga-Zamalloa 等人[49]研究了 CTCL 细胞与已知在疾病进展中起关键作用的淋巴瘤相关巨噬细胞之间的相互作用，并证明自分泌集落刺激因子 1（CSF1）激活 AKT / mTOR 信号传导并促进 T 细胞淋巴瘤的活力。在与 CSF1 受体结合时发生激活，该受体由巨噬细胞和淋巴瘤细胞高度表达。
同样有趣的是，参与瘙痒机制的 IL-31/IL-31 受体轴（SS 最严重症状之一）[50]能够驱动 PI3K/AKT 信号传导在多种皮肤病中[51]。
免疫组织化学证实，通过检测高水平的 AKT、mTOR、P70S6K、S6RP 和 4EBP1 磷酸化形式，该途径在皮肤浸润的 SS细胞中被激活[46，52]。我们通过证明这些蛋白质（特别是 mTOR）的磷酸化水平更高，以及与同时从相同患者获得的血液来源的 SS 细胞相比，皮肤衍生的 SS 细胞中的增殖指数更高，从而进一步加深了这一方面[31]（图 图 1）。我们还证明，SDF-1 和CCL21 趋化因子在 SS 组织中均过表达[53，54，55，56]，在原代 SS 细胞和 SS 衍生细胞系中诱导 mTORC1 信号激活，细胞增殖和 Ki67 上调。
因此，皮肤 - 血液比较方法展示了皮肤如何上调 PI3K / AKT / mTORC1 信号传导，并指出了发现支持潜在复合靶 SS 细胞生长和扩增的新生化信号的策略（图 图 1）。
4. 循环 SS 细胞肿瘤内异质性研究进展 RNA 测序（RNA-seq）等高通量技术代表了深入研究肿瘤异质性的转折点。基本上有两种 RNA-seq 方法：bulk RNA-seq和单细胞 RNA-seq（scRNA-seq）。本体 RNA-seq 为每个转录本提供样品中的平均表达水平，其可包含不同的细胞类型[57]。相反，scRNA-seq 能够检测即使在本体 RNA-seq 中的小亚克隆中表达的基因。因此，它提供了更高分辨率的细胞差异，并更好地理解单个细胞在其微环境中的功能。
最近，流式细胞术[28 ，58，59]、TCR 测序[60，61]、TCR 克隆性和表面蛋白表达等几种不同的高通量技术已与 RNA-seq或 scRNA-seq 分析结合使用，以进一步了解细胞异质性和 SS 细胞产生的失调基因表达。
这些新研究中的第一项将表型表征与 RNA 表达相结合，由 Roelens M 等人进行[28]。使用八色流式细胞术，作者使用 TCR Vb + CD158k +或 CD158k +（KIR3DL2）染色与其他特异性 T 细胞标志物组合，表征了来自 45 名患者的循环 SS 细胞。他们观察到克隆 SS 细胞与 CM 表型不均匀相关，但它们包括幼稚（TN），过渡记忆（TTM），效应记忆（EM）和干细胞记忆（TSCM）克隆亚群的次要部分。这最后一个亚群的特征是 FAS 受体表达（CD95），其影响细胞凋亡抵抗[62，63]，如成人 T 细胞白血病报道[64]。该研究首次强调了克隆性 SS 细胞的巨大多样性，揭示了表型 SS 细胞异质性的概念（图 图 2）。
为了找到特定的 SS 细胞表达特征，作者随后比较了来自三名患者的 TN，TCM 和 TSCM SS 细胞与来自三名健康供体的健康细胞对应物的转录谱。结果揭示了所有 SS 细胞亚群的共同特征，主要由 CD158k，T-塑胶和 Twist 的过表达表示。这些结果可能部分受到基于 CD158k 染色的恶性淋巴细胞阳性选择的影响，CD158k 染色似乎不是 SS 细胞独有的标志物，正如最近的研究所观察到的那样[65，66]。
在另一项研究中，Borcherding 等人[60]在匹配的分离 SS 细胞和来自一名 SS 患者的正常 CD4 +细胞中结合 scRNA-seq和 T 细胞受体测序分析。基于 mRNA 表达，作者区分了正常 CD4 +细胞中的六个簇，这些簇似乎主要与幼稚表型相关，以及SS 细胞中含有与 CM-T 细胞一致的表型的五个簇。发现的每个簇都由前 5-7 个基因的表达定义。为了鉴定 SS 的新标记物和/或治疗靶点，作者通过突出显示一系列差异表达的基因来比较配对恶性细胞和正常细胞的转...