[摘要] 用电穿孔方法结合化疗药物治疗肿瘤，给予相对较少剂量的化疗药物就能杀死肿瘤细胞，这两者的结合称为电化学疗法（ECT），其优势是疗效提高、同时毒性降低。ECT在细胞实验、动物实验和临床试验中取得了显著成效，电穿孔治疗仪的研发和应用加快了这种治疗方法的进步。研究者们还探索高强度电场的陡脉冲使肿瘤细胞发生不可逆的穿孔从而导致肿瘤细胞死亡的现象，并展现出广阔的应用前景。
[关键词] 电穿孔；电化疗；肿瘤治疗；不可逆电击穿
[中图分类号] R730.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2014）09-48-05
Effect of electroporation therapy in treatment of tumor: A research progress
DING Wenjin LUO Song SU Shengfa OUYANG Weiwei
Department of Tumor, Affiliated Hospital of Guiyang Medical College, Tumor Hospital of Guizhou Province, Guiyang 550004, China
[Abstract] The combination of electroporation treatment of cancer chemotherapy drugs, given the relatively small doses of chemotherapy drugs can kill tumor cells, called electrochemical combination of the two treatments (Eletrochemotherapy, ECT), its advantage is to improve the efficacy, while reduced toxicity. ECT has achieved remarkable success in the experiment, the cells of animal experiments and clinical trials, the development and application of electroporation therapy device to speed up the progress of this treatment. The researchers also explore the steep high-intensity pulsed electric field causes the tumor cells leading to irreversible phenomenon perforation death of tumor cells and show a broad application prospects.
[Key words] Electroporation; Electric chemotherapy; Cancer treatment; Iirreversible breakdown
恶性肿瘤近年来在人群的发病逐年升高，严重影响患者的健康和生命，成为当之无愧的“死亡杀手”。医学界对肿瘤治疗的研究正不断深入，目前临床治疗肿瘤的方法有手术、化学药物治疗、放射治疗、分子靶向治疗、生物治疗以及他们的联合应用等。其中化疗药物的毒副作用严重制约着化疗药物的应用，主要与剂量的大小有关，所以如何用低剂量化疗药物既减轻副作用又达到最佳的治疗效果，将细胞膜电穿孔来提高化疗的疗效就是一种很好的降低用药剂量治疗肿瘤的方法。电穿孔疗法（electroporation therapy，EPT）是一种治疗恶性肿瘤的新技术，其特点是能够提高化疗药物向肿瘤细胞的扩散，并且对肿瘤细胞具有选择性，避免了正常组织的损害，具有成功微创治疗肿瘤的应用前景。以下就介绍电穿孔效应机制、实验研究以及电穿孔疗法研究现状和展望。
1 电穿孔效应
1.1 可逆性电穿孔
细胞膜电穿孔是一个极其复杂且瞬变的过程，
目前人们通过现有的检测手段还没有彻底研究明白细胞电穿孔发生的具体机制。研究表明，细胞膜电穿孔的瞬时改变是一个动力学过程，一般分为三个阶段：（1）初级阶段，指在施加电场后大量微孔形成阶段，此阶段在几ms内瞬间形成；（2）继发次级阶段指膜上微孔直径迅速扩大与细胞骨架网孔为边界的大小基本一致，一般发生在几个ms内，此时微孔状态基本稳定；（3）脉冲后效应阶段，细胞膜上的电致穿孔不断缩小，直至复原。不同电脉冲作用的结果还可使微孔不断扩大，细胞的内环境遭到破坏，出现细胞破裂甚至死亡。人们长期对细胞膜电穿孔机制的研究提出了各种模型，这些模型大都有个共同点，即都是一个球形细胞模型，并且为细胞膜设置一个临界电位。在正常生理情况下，细胞膜形成了一道屏障，可保持细胞内环境的相对稳定，既参与同外界环境进行物质交换，又对某些物质的交换有阻碍作用。当施加电压刺激超过膜上临界电位时细胞膜的通透性增加，使细胞膜上出现暂时的微孔现象，从而为亲水性大分子顺利通过细胞膜提供了路径。作用于细胞的脉冲停止后，基本上细胞膜通过自身复原，从而在结构与功能上不发生改变[1]，这种在短时电脉冲作用下细胞膜出现暂时微孔并可复原的物理过程称为电穿孔[2]即可逆性电穿孔。当细胞膜发生电穿孔时，细胞膜的电阻会瞬时减小，正常情况下不能通过细胞膜的分子（DNA、蛋白质、病毒、药物等）得以进入细胞，Hofmann由此提出了肿瘤的电穿孔疗法[3]。比如用电脉冲作用于肿瘤细胞结合博莱酶素（BLM）、顺铂（DDP）等治疗肿瘤，出现阳性区超极化，阴极区发生去极化[4]，其需要条件是脉宽为us~ms、强度达kV/cm，在这种电脉冲（EP）作用下细胞膜的静息电位发生改变。邵林等[5]指出通过控制电场在肿瘤组织中的强度和场分布，可引起细胞膜通透性增大，该电场可使细胞膜在数秒内形成直径20~40nm的电致微孔，细胞内物质瞬时从微孔中喷射而出，整个过程发生于20ms内，并伴随孔洞直径扩大20~100nm。当膜上微孔直径迅速扩大与细胞骨架网孔为边界的大小基本一致，之后趋于稳定，接着由于细胞膜类脂双分子层的重新排列以及膜内外渗透压的作用，微孔可不断缩小直到复原，表明电穿孔是可逆的。
1.2 不可逆性电穿孔
随着对细胞施加电脉冲的增加达到阈值时，细胞的破坏使其内环境无法维持，出现不可逆的电穿孔甚至死亡，这种现象称作不可逆性电击穿（irrecversible electroporation，IRE），且目前已用于医学领域的研究中。不可逆的电穿孔是一种非热、微创、局部消融的技术，利用电脉冲使细胞膜出现不可逆的纳米级孔隙从而杀死组织细胞。姚陈果等[6]认为细胞在很强的电场应力作用下，产生细胞膜和核膜的电穿孔，打破了细胞内外的离子平衡，引起细胞破裂；单个脉冲作用结束后细胞会发生愈合，而增加陡脉冲的频率和脉冲剂量，通过电脉冲作用的叠加，微孔则难以愈合。猜想这种结果是通过脉冲对细胞膜和核膜微孔量及孔径的大小穿孔作用的累积而导致不可逆的电穿孔，借助于光镜、电镜对作用后细胞膜的观察充分证实了这种真实性。
1.3 局部血管改变
肿瘤的生长、转移和复发都需要新生血管的生成，脉冲作用下的两个极区中，阳极区的反应为血管的收缩反应，伴有微血栓形成；阴极区则发生明显的间质水肿，组织间液对血管的压迫作用；不管阳极区还是阴极区的反应，最终结果是使肿瘤区域的血供减少或者切断肿瘤的营养供给[7-8]。研究结果表明[1]电化疗法能显著抑制血管内皮生长因子的表达，抑制肿瘤微血管的生成，同时可使肿瘤血管内皮细胞破坏，部分血管栓塞；另外，毛细血管及淋巴管通透性增加，局部充血水肿，导致静脉回流受阻，肿瘤组织供血减少，最终抑制肿瘤生长或者治愈肿瘤。
1.4 高选择性
癌细胞的体积平均比正常细胞大，所以要求穿过癌细胞的磁通量也比正常细胞大；作用在恶性肿瘤细胞膜上的电场应力的数量级比正常细胞大1个数量级[6]。因此，通过利用这种原理使陡脉冲电场作用于恶性肿瘤细胞，其敏感性比正常细胞大，同样的电场应力势必对肿瘤细胞造成更大的损伤，所以通过实验证实了电穿孔方法具有一定选择性。
1.5 免疫增强效应
研究表明，机体免疫功能低下者更容易患恶性肿瘤，而且肿瘤患者体内可产生免疫抑制因子，使机体的免疫功能大大降低。Miyazakis等[9]研究Balb/c小鼠皮下接种结肠癌26细胞，用低电压-电穿孔结合化疗药物BLM处理，指出在低电压-电化学过程中伴有T细胞依赖性肿瘤特异性保护性免疫的产生。米彦等[10]研究结果表明，电脉冲治疗肿瘤能明显增强大鼠脾淋巴细胞的增殖反应（P＜0.05）、显著提高大鼠NK细胞的活性（P＜0.05）和大鼠腹腔巨噬细胞产生TNF-α的能力（P＜0.05），诱发机体抗癌免疫反应，从而导致荷瘤鼠机体细胞免疫功能增强。
2 肿瘤的电穿孔疗法及其研究
通过电穿孔结合化疗药物治疗肿瘤，展现出以下优点：（1）抗癌药物的剂量远远低于常规化学治疗，故减小了不良反应；（2）对于某些不可切除的肿瘤可以给予一定的治疗；（3）对于某些靠近重要器官的肿瘤，如果用外科手术或放疗将带来永久性损害，可用EPT来弥补；（4）可用单一药物进行治疗，克服了多种药物带来相互抵消及毒性增加的副作用。
化疗药物BLM不能有效通过细胞脂质双分子层膜，因此传统的用药剂量往往比较高，但与电穿孔结合可以增强其细胞毒性。Kitamura[11]在小鼠背侧移植NR-S1癌，将博莱霉素注射到肿瘤周边，同时该肿瘤被固定用电脉冲（40V/cm）作用，3次/d，每周4d，持续2周。疗程为8周，结果发现10只荷瘤鼠中有4只肿瘤完全消失，低电压-电化学通过使细胞坏死与凋亡的方式验证了其细胞杀伤作用。Cemazar等[12]的一项A/J鼠SA-1肿瘤实验中发现ECT能提高肿瘤细胞内的DDP含量以及增加DDP与核内DNA的结合数量，得出EPT结合DDP治疗肿瘤时DDP的细胞毒性比单用DDP时增加20倍。Jaroszeski等[13]建立大鼠肝脏肿瘤模型，肿瘤周边注射BLM然后施用电脉冲，根据对肿瘤体积及组织学标本的两组对比，发现电化疗组的有效率为26.67%~93.33%，而且小鼠完全能耐受。Horiuchi等[14]用人子宫平滑肌肉瘤细胞（SK-LMS-1）皮下植入裸鼠，低量电脉冲（100V/cm） 结合肿瘤周围注射BLM，结果发现电化疗组肿瘤明显消退，病灶处BLM的浓度比那些只有BLM肿瘤高10倍，从而证明了ECT可能治疗人子宫平滑肌肉瘤的价值。
王保义等[15]采用低于常规剂量的化疗药物盐酸阿霉素及BLM，利用ECT技术治疗植入昆明鼠体内的S180肉瘤，观察肿瘤生长情况，并解剖肿瘤组织进行组化分析，结果显示：电化疗法作用最强，肿瘤细胞的生长明显抑制，抑瘤率为95%，抑瘤效果均明显高于药物组和电场组；组织切片发现电化学治疗组肿瘤内部血管密度减小，肿瘤细胞数量减少，说明电化疗作用可抑制肿瘤血管生成；通过细胞超微结构的观察发现电化学协同作用比电脉冲或者药物对肿瘤细胞的毒性更大。通过药效对比，盐酸阿霉素的效果强于博莱霉素。
Rodriguez等[16]研究ECT治疗15例皮肤癌38处皮损参加的Ⅱ期前瞻性临床试验，平均随访时间为8.6个月。结果显示整体客观反应分别为98％，而49％获得完全缓解，49％部分缓解，并且在2％没有反应。Soden等[17]报道了ECT中的阵列电极的研究，指出电穿孔疗法与化疗药物联合使用比只给化疗药物或只给EP的疗效都更为显著。
Nanda等[18]将人类胰腺肿瘤（Pan4-JCK）皮下植入到裸鼠体内，用EPT使用博来霉素、丝裂霉素C或卡铂单药治疗，监测它们对肿瘤生长的影响。结果显示：无论是药物或脉冲单独治疗的肿瘤表现为肿瘤的生长增加。但是，在使用三种药物中的任何一个与EPT治疗的肿瘤表现出肿瘤显著的消退。药效的顺序是：BLM＞MMC＞卡铂。
张弘等[19]通过实验研究了ECT治疗异种移植人卵巢癌SKOV3裸鼠，结合使用的化疗药物为DDP。研究表明：肿瘤生长统计结果为电化疗组肿瘤体积和瘤重都最小，相对生长速率最低；血清CA125结果为电化疗组和电场组的裸鼠均明显低于药物组和对照组，说明高电场电脉冲还可降低肿瘤标志物的表达；对血管内皮生长因子的检测结果为受体KDR的表达明显减少，说明EP可减少肿瘤血管的生长。
电穿孔疗法结合化疗药物治疗肿瘤有其独特优势，但ECT的研究大多处于动物实验和临床试验阶段，且ECT治疗肿瘤的适用范围还较窄，并且缺乏临床大宗病例的支持。因此，为发展ECT对肿瘤的临床治疗，应该做到：（1）扩大ECT治疗不同肿瘤的研究，比较疗效；（2） 针对不同部位的肿瘤（特别是深部肿瘤），适当调整阵列电极的结构并便于操作；（3）制定合理的电化学疗法指南，包括不同部位肿瘤治疗的最佳电脉冲参数、最小的化疗药物剂量和疗程等；（4）提高患者的顺应性，促进临床应用。
3 电穿孔治疗仪研究现状
电穿孔治疗仪的研制，目前以美国的MedFulser系统最著名。Medpulser系统主要由电脉冲发生器和经消毒处理的电极阵列针组成。治疗时的操作过程十分简单，针对不同的临床治疗需要，可以进行多项参数指标调节和选择，同时配备针对特定肿瘤尺寸和CD成像位置的最佳电极阵列。MedFulser系统中每对电极间产生的电压幅度和脉冲发生周期都经过了严格的理论电场计算和实验研究，目前这套系统已应用于临床肿瘤治疗中。
根据高压脉冲引起细胞IRE而使组织消融的机制，应用现代电子电力技术、高电压技术及嵌入式技术，周平等[20]研制出独立可调输出脉冲频率、脉宽和峰值参数的高压方波脉冲的肿瘤消融装置。高压方波肿瘤消融装置结合细胞电穿孔原理，参数设置为输出脉冲峰值为0~3000V，宽度为10~100ps，频率为10~100Hz，指标符合产生最佳热效应的脉冲电场所需的波形要求，脉冲输出功率可达150kW。当输出方波脉冲峰值参数为3000V时，可确保40cm3范围的组织场强在800V/cm以上，有将近50~70cm3范围的组织细胞出现IRE效应。方法是使用直径为1mm的六针环形阵列电极，插入体表皮肤进行肿瘤消融，其优点为最大限度地减少治疗对患者的影响和开放式手术的弊端。在实验室连接电阻负载调试，装置运行良好，输出的方波脉冲波形符合IRE研究需要，同时也为将来针对离体细胞和动物荷瘤的IRE实验打下基础。
4 展望肿瘤治疗新途径
ECT发挥的最大作用是增加细胞毒性，但依然不能解决化疗药物带来的毒副作用。随着研究的深入，发现单用电脉冲逐渐增加剂量，可导致细胞出现不可恢复的破裂而死亡，发挥IRE作用。所以，人们逐步将脉冲电场IRE作为一种单独治疗手段进行研究。IRE原理是作为新型的肿瘤治疗方法，其优点包括能保护重要结构和器官不受损害，灭活时间短，最适用于对浅表肿瘤的治疗，整个过程可以有效控制对肿瘤组织的杀伤范围，达到微创治疗的效果[21] ，还可以实时监控。不可逆电穿孔特殊的灭活机制，引起学者们极大的兴趣，并取得了巨大的进步，具有广阔的临床应用前景。
Beebe等[22] 研究发现单纯使用场强26~300kV/cm、脉宽10~300ns的EP可并有效抑制肿瘤生长或导致肿瘤细胞发生凋亡。姚陈果等[23]研究了脉冲上升时间＜160ns、场强100V/cm、脉宽2537us的指数衰减脉冲，直接利用细胞的IREB特性来杀伤肿瘤细胞，发现陡脉冲电场能明显减小荷瘤BALB/c小鼠恶性肿瘤的体积、并抑制细胞增殖，表明陡脉冲电场能有效治疗恶性肿瘤。
Joshi等[24]建立了细胞的动力学模型研究，得出细胞可以在陡脉冲电场中存活，并且细胞膜上的众多微能够修复，但如果陡脉冲电场达到一定程度，相邻近的很多较小微孔融合之后，形成很多半径较大的微孔，结果就可能导致细胞IRE。姚陈果等[25]以人卵巢腺癌SKOV3细胞为研究对象，逐渐增加陡脉冲剂量，癌细胞的死亡率和抑制效应更加显著，在细胞水平上，表现为抑制肿瘤细胞的增殖；在染色体水平上，影响到细胞周期。
Neal等在体外实验应用IRE治疗MDA-MB-231人乳腺癌细胞，确定其基线电场阈值（1000v/cm），及引起IRE的脉冲参数，模拟IRE治疗三维数字模型，指出此方法能够治疗较大范围的不均质靶区而不引起显著热损伤，使得IRE成为治疗乳腺癌有效手段[26]。
杨晓燕等[27] 研究陡脉冲作用于新西兰大白兔VX2肝脏肿瘤，结果表明：IRE可引起兔肝脏肿瘤凝固性坏死，坏死轮廓与电场仿真图基本吻合，在IRE治疗后4周左右，实验组大白兔均良好地存活，经超声检查证实肿瘤无增大及转移征象，从而也证明IRE治疗的有效性。
综上所述，虽然国内外对陡脉冲电场治疗肿瘤的研究已取得一定进展，但IRE的病理生理机制也还尚未清楚。nsPEF（纳秒级脉冲电场）技术为恶性肿瘤治疗提供了一种独特的、高能力、无能量依赖性的治疗手段。其抗肿瘤机制比较复杂，除了直接破坏肿瘤细胞外还可诱导其凋亡，具体机制可能与线粒体跨膜电位下降关系最大。加强对其机制的深入研究，相信能为肿瘤的治疗做出贡献。
5 结语
电穿孔疗法结合化疗药物能增加进入肿瘤细胞的药物剂量，从而实现化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用，一定程度上降低化疗药物的毒性反应。还通过大量实验探讨陡脉冲电场作用于肿瘤细胞发生不可逆性电击穿使其死亡，疗效显著。由于电穿孔疗法取决于各种物理、化学以及生物学参数，横跨多门学科，所以对细胞电穿孔研究应不断的深入，人们才会更加清楚电穿孔现象及机制，从而更有效的用于肿瘤的治疗。
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（收稿日期：2014-02-13）