[摘要] 药品微生物检验是药品质量控制的重要环节，也是保障公共用药安全的重要途径。微生物检验结果是进行风险调查、风险评估和风险管理的重要参考指标，也是改善过程控制效果的重要依据。该文从药品微生物检验标准、检验检测方法、菌種与培养基、环境控制和仪器设备等方面阐述药品微生物检验质量的影响因素。
[关键词] 微生物检验；质量控制；影响因素；风险评估；假阳性或假阴性
[中图分类号] R95 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2017）07（a）-0026-04
Analysis of Influence Factors of Laboratory Quality Control of Drug Microbiology Test
ZHANG Guo-lin1，2
1.Center for Drug Control and Testing， Suzhou， Jiangsu Province， 215000 China；2.Nanjing University of Traditional Chinese Medicine， Nanjing， Jiangsu Province， 210000 China
[Abstract] The drug microbiology test is an important link of drug quality control and it is also the important way to ensure the public medication safety， and the microbiological test results are the important reference indexes of risk survey， risk evaluation and risk management and an important basis for improving the course control effect， and the paper elaborates the influence factors of drug microbiological test quality from the test standards， test and inspection method， strains and culture medium and environment control and instrument.
[Key words] Microbiology test； Quality control； Influence factors； Risk evaluation； False positive or false negative
药品微生物控制是药品质量控制的重要环节，微生物检验结果是进行风险调查、风险评估和风险管理的重要参考指标[1-2]。不同于理化检验，微生物检验属于活体检验，结果容易受到多种内外因素的影响，如检验环境、培养基质量、菌种活力等。2015年版中国药典（以下称 “新版药典”）已经解决了与ICH协调案的协调问题，达到了一部、二部、三部通则的统一，实现了与国际标准的全面接轨，并强化了对药品微生物检验中操作关键点的控制[3]，而关键点的控制正是药品微生物检验实验室质控的关键方面。在现代的GMP生产条件下，药品微生物污染属于小概率事件，且污染具有不均一性的特点，无法通过复试来确认结论，故目前各国法规均要求对异常结果（out of specification，OOS）进行有条件复试[4]。因此，分析检验异常结果的来源、控制影响检验结果的因素显得十分重要。探索影响微生物检验实验室质量的相关因素，避免假阳性或假阴性的出现对提供准确、可靠结论、进行有效过程控制和风险管理具有重要的价值。该文从标准、检验检测方法、菌种与培养基、环境控制和仪器设备等方面阐述药品微生物检验的影响因素。
1 检测标准与方法
确认标准与方法的现行有效是进行检验检测工作的首要任务。目前国家食品药品监督管理总局也制定了《药品标准管理办法》（目前为征求意见稿阶段）来规范药品标准的制定和修订工作。药品标准涉及国家标准、药品注册标准、各省级食品药品监督管理部门制定的地方药材标准、中药饮片标准、医疗制剂标准、行业标准及国外标准等。标准与方法既要强调标准的科学性，也要统筹可操作性。新版药典解决了与ICH协调案的协调问题，实现了与国际药典的有效统一。同时，新版药典对检出控制菌的鉴定手段有了理念上的重大转变，强调可根据实验室特点进行微生物的鉴定。虽然未对方法进行统一规定，但对微生物实验室的质量控制提出了更高的要求。药品的生产工艺、检验方法以及相关的质量控制技术要求属于药品的通用技术要求，应当制定国家标准。同时，对于已批准上市生产的药品国家标准应由国家药品委员会对需要修订的标准组织修订。经过多年的改进，药品微生物检验的标准与方法在不断完善，微生物限度及无菌检查的方法学验证资料也在不断充实，但在实际工作中仍碰到一些标准与方法在操作上的具体问题，举例如下。
标准不明或不完善。在实际工作中曾接触到乙醇的微生物限度检查的委托检验，但生产企业无法提供具体的用途与检验检测方法和标准，故在进行控制菌检验时将检查项目确定为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。进行控制菌检查时通常在供试液制备完成后应进行预增菌，然后进行选择性培养基分离与鉴定，但实际工作中相关企业提供的方法学验证资料中竟有采用平皿法进行控制菌检查的实例。另外，进行中药制剂的微生物限度检验时通常需要根据工艺处方的“制法”以确认是否进行大肠菌群或耐胆盐革兰阴性菌和沙门菌（新版药典）的检查。通常情况下药品标准里都包含“制法”，但部分品种中不包含此项。在无法及时获得相关资料时，应采用从严标准进行检测。当方法无法在特定的实验室进行检验时，新版药典提供了药品微生物检验替代方法验证指导原则，为微生物检验实验室出于各种原因的如成本、生产量、快速简便及提高质量等采用非药典方法提供了依据。
样品供试液均匀制备是取得准确、可靠检验结果的首要步骤。微生物限度检查供试液制备的主要目的是将供试品中的微生物提取并尽量分散均匀。当供试品无法制备成均一溶液时，在制备供试液进行下一步检查前应用力震荡，使供试品中的微生物尽量分散均勻。对水不溶性供试品供试液的制备需根据样品的特性采取合理的方法。如贴膏剂供试品无法制备成均一溶液，通常将其黏贴面上贴一层多孔纱布剧烈震荡，尽量分散后再进一步试验；进行敷料类供试品微生物限度检查时应在无菌条件下将供试品剪成尽量的小块再进行下一步操作。
进行薄膜过滤法检查时抑菌性的消除程度是影响检验结果的关键因素因素，故需要对冲洗量、冲洗次数及流速等进行合理控制。合理的冲洗量一方面可以有效去除样品的抑菌活性，同时也有利于对结果的准确判定。采用薄膜过滤法进行抗生素检查是消除其抑菌活性的主要手段，但进行脂肪乳检查时则主要考虑的是利于结果观察。该研究在进行中长链脂肪乳无菌检查时发现冲洗量相差100 mL时无菌滤筒中残余中长链脂肪乳对最终结果的观察影响差异非常明显。薄膜过滤法冲洗量也不宜过大或过滤压力过大，以避免造成微生物的活性下降甚至死亡或破坏滤膜的完整性。冲洗液的流速要合理控制，尤其是颗粒较大容易堵塞过滤孔的供试品，如中长链脂肪乳。若为增大过滤速度而增大蠕动泵的速率，则可能造成滤膜穿孔而造成结果的无效。药品检验机构对同品种的批量检验供试品建立针对品种的可执行的SOP是有益的尝试。
合理的阳性与阴性对照是保证检验方法准确和结果准确的重要手段。阴性对照可以有效地排除供试品以外的因素对结果造成的影响，而阳性对照是确保所采用的方法适合特定品种检验的需要。虽然目前美国药典对无菌检查的阳性对照无要求，但在目前接触到的微生物检查方法来看阳性对照是必须的。例如在进行抗生素检验后一旦溶解抗生素的容器清洗不彻底（虽然发生的概率极低），残留的抗生素会影响下批次供试品中微生物的检出。
2 洁净操作环境
新版药典对微生物检查环境最终确定为“实验环境应符合无菌检查/微生物限度检查的要求”，与2010年版中国药典的论述有了一定的变化。考虑到检验环境应不低于生产关键区域环境的原则，为确保药品检验实验室检验结果的权威性，药检机构应将无菌检验的环境条件控制在B级背景的A级层流环境下，或采用无菌隔离器进行检验。
洁净室设计、布局与性能确认。微生物检测实验室的设计和布局应考虑实验设备的安装、良好的微生物实验室操作规范，避免环境对样本的污染以及菌种之间的交叉污染，并防止有害生物因子污染环境。通常微生物限度室、无菌室、抗生素检定室及阳性操作室应从空间上进行分离，防止相互之间交叉污染。基于生物安全的角度，阳性室空调直排系统应独立设置，并维系与相邻房间的负压状态。该研究在进行辖区内医疗器械生产企业洁净环境监测时发现部分阳性洁净室仍未设计为负压，部分洁净室虽然设计为负压，但未选择合适的负压压差表，造成压差显示不正确。洁净区的墙壁、地面应光滑、平整无裂缝，接口严密，无颗粒脱落。建筑材料应利于清洁、消毒和灭菌，以减少污染的风险。洁净区高效过滤器的额定风量与空调机组的性能相匹配，确保洁净室内悬浮粒子浓度保持在较低的水平。由于微生物通常附着于悬浮粒子上，空调净化系统的优劣也直接影响环境中微生物的控制效果。另外，除了阳性室应维持负压外，不同洁净度的洁净室之间应保持合理的压差梯度。
药品微生物检查洁净区应定期进行清洁和消毒，并在日常使用过程中进行洁净环境、表面微生物等的监测。由于洁净环境与外部普通环境会有人员和物料的交流，通常无法保证绝对的无菌。现有的国家标准对不同洁净度级别的环境微生物限度标准进行了相应的规定。国家标准通常为最低的要求，在日常的使用过程中要加强对洁净区生物因子变化的趋势性分析，并设立警戒限度和纠偏限度。在洁净室风险评估与风险控制中，也要将统计学分析方法纳入其中。统计学中通常将（x±2SD）设为警戒线，（x±3SD）设为行动线（纠偏限）。陈伟盛等[5]通过对洁净环境的监测数据进行统计分析，实现了对洁净室的污染评估和风险控制，并设立了实验室相应的警戒限。当环境监测结果超过警戒限度或纠偏限度时应采取相应的措施。同时，当环境微生物监测结果出现趋势性变化时也应分析原因并采取相应的措施。虽然洁净环境的控制能够有效降低微生物污染的风险，但并不能完全排除。由于微生物污染发生的小概率性和不均一性特点，药品微生物检测过程中通常进行有条件的复试。因此，强化检出菌的鉴定与溯源、排除外部环境因素对结果的影响显得十分必要。目前药检系统已经开始逐步建立环境菌库[1， 6-10]，该研究也收集了近年来无菌检查环境的微生物并初步建立的无菌检查环境菌数据库。
3 培养时间与计数
培养时间。药品中微生物通常受到不同程度的损伤或抑制，活力相对较差，恢复生理状态至长成肉眼可见的菌落需要一定的时间。中国药典中规定需氧菌总数需培养3～5 d，霉菌和酵母菌培养5～7 d观察。因此，为了使样品中的微生物充分生长，需培养5d（需氧菌）或7 d（霉菌和酵母菌）。当需要时，要适当延长培养时间。但部分微生物在计数平板上会呈现蔓延式生长，影响最后的计数结果判定。为了避免蔓延生长造成的计数误差，通常需要逐日观察。但应当注意的是霉菌培养过程中若要观察，应小心轻放，避免孢子分散后重新长出菌落影响结果。新版药典的霉菌和酵母菌计数采用沙氏葡萄糖琼脂培养基，其对细菌无明显的抑制作用，但由于霉菌和酵母菌限度标准相对较低，因此当计数结果有异议时应加验证量的抗生素重新进行计数确认。应当指出的是当进行计数的方法学验证时应在药典规定的最短时间内培养计数，即需氧菌总数培养3 d，霉菌和酵母菌培养5 d观察。
微生物限度检查通常采用不同稀释级进行分别计数并进行结果分析。由于微生物在供试液中的分布特点导致其不同稀释级的计数结果可能存在误差，不完全一致。与以往药典规定不同的是新版药典要求取最高的平均菌落数进行报告。但应当指出，不同稀释级计数结果存在较大的差异性时应首先分析造成的原因。例如当样品存在较强的抑菌性而未完全消除时，最终高稀释级的菌落计数会明显多于低稀释级的菌落数，造成结果判定的错误。新版药典对通用的微生物限度标准规定为指数形式，如104 cfu可接受的最大标准为20 000 cfu。但对于品种项下的规定或限度标准中丸剂的3×104 cfu应为具体数值。
4 复试与重试问题
在现代GMP的生产条件下，药品受到微生物污染是高度随机的小概率事件。同时，样品微生物污染也是高度不均一的。因此，当出现超标结果或结果异常时需要展开回顾性的质量调查。若可以排除外在的因素影响，则样品不得复试。但是当分析发现操作过程中影響结果的人员、试剂、环境、方法等不符合规定时应进行调查分析，确定是上述因素引起的结果异常而非样品本身原因时，应进行重试。
5 人员与仪器设备
随着现代科技的发展，各种新型的仪器不断出现，仪器在微生物检验工作中的重要性越来越得到体现[2]。检测工作要使用计量检定合格的仪器设备。但在实际工作中可能出现计量部门无法进行计量仪器，如全自动微生物生化鉴定分析仪。对计量部门当前无法计量的仪器，可以采用标准物质进行检测分析判定其准确性，如全自动微生物生化鉴定分析仪可以采用标准菌株进行验证确认。压力灭菌器是培养基除菌的重要设备，也是影响检验结果、保证生物安全的重要设备。但高压灭菌器性能不佳或使用不当会对结果造成误差，如压力灭菌器升温缓慢会导致培养基过热造成过度灭菌，破坏培养基的促生长能力。人员素质是微生物检验质量第一位的影响因素。从事微生物检验人员应具备微生物相关的基础理论知识和试验技能，应具有医药学相关的理论知识，并不断接受新理论、新方法的技能培训。由于微生物检验工作的特殊性，实验人员应经过实验室生物安全方面的培训。对特定岗位人员从事新工作时需要进行考核和授权，以确认检验人员能够适应新的岗位职责。同时，应定期组织开展人员比对、能力验证、内审及使用标准菌株等以提高检验人员的综合素质。对于人员的培训、考核等均应记录并归档。
6 培养基、菌种与生物安全
培养基是进行微生物检测与分析的物质基础，选择合适的培养基品牌及制备和保存方法是提高检验准确性的重要措施。但目前市售的培养基质量参差不齐。培养基在使用前除进行外观验收（如颜色、是否结块）外，应进行适用性检查，以确认满足特定用途要求。目前中国食品药品检定研究院已提供大部分药品对照培养基供培养基适用性检查实验。但也有个别培养基未查询到对照培养基的出售，如血平板。该研究认为对无法获得对照培养基的培养基适用性检查时可以采用标准菌株或典型菌株进行检查，并可以与目前的主流品牌培养基或上批次在用进行比较。鉴于培养基对实验结果的影响，培养基采购时应严格供应商资质审核，一旦确定后尽量避免不断更换。新到货培养基应进行外观和技术性验收（可参考SN/T1538和ISO/TS11133），确保培养基的质量。新版药典中无菌检查用的培养基由硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基并更为硫乙醇酸盐流体培养基和TSB培养基。考虑到制药用水中寡氧微生物的生长环境，新版药典对纯化水检测培养基定为R2A。某些特定的培养基应采取适当的处理措施，如糖发酵培养基分装容器一般进行预先灭菌；配置过程如需加热助溶的应避免过度加热，防止颜色变深、琼脂凝固力或pH值改变；有添加成分时应按照使用说明书要求进行操作，并注意充分混匀。适宜的pH值是微生物生长所必须的条件，但培养基灭菌前后通常pH值会发生变化。因此，应确保每批培养基灭菌后在25℃条件下pH达到规定。琼脂培养基不得进行反复融化，不得保存于0℃以下条件。另外，应密切留意培养基可能的残留或其他状态，如硫乙醇酸盐培养基中的琼脂可能会残留结块而影响无菌检查最终结果的判断。实验室应制定相应的培养基质量控制程序，并对pH值、稳定性、有效期及适用性试验等进行常规监控。标准菌株是微生物检测过程中的标准物质。标准菌株性状的典型与否直接影响检验结果的准确性。因此，标准菌株应从认可的国内外菌种保藏机构获得或使用与标准菌株所有有关特性等效的可以溯源的商业派生菌株（后者仅可作为工作菌株），并于适宜的条件下保存。同时，在标准菌株的保藏过程中应定期对其进行纯度分析，并确保生物学性状和特性的典型。工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过5代，以防止菌种发生变异风险。除了标准菌株外，环境中常见的污染菌株也可作为培养基适用性检查的菌株，以利于目标性污染菌的检出。生物安全是微生物检验实验室应密切关注的问题。对于菌株（种）、阳性培养物应采取适当的措施（高压灭菌）后再按普通废弃物处理。同时，过期培养基也应考虑基于生物安全的处理措施。
应当指出的是上述影响因素均属于内部质量控制范畴，而在内部质量控制的基础上也应注意外部质量控制的重要性。外部质量控制也是药品微生物检验实验室质控的重要方面，能力验证和实验室间比对是检验检测质量保证的重要组分，也是对实验室检验检测能力综合判断和内部质量控制效果检验的重要手段。能力验证是对人员、仪器设备、环境设施、试剂耗材等的全面考核，有利于实验室水平的提高和实验室质量控制的不断改进。
7 总结
药品微生物控制是药品质量控制的重要方面，微生物的检测结果是进行风险评估与风险管理的重要依据，也是加强生产及检验过程控制的重要参考。该文从检验检测方法、标准与方法、菌种、培养基、环境和仪器设备等方面对其可能影响微生物检验结果进行了综合分析，对检验实验室质量控制与提高提供了一定参考。但由于微生物检验的特殊性，影响药品微生物检验结果准确性的因素还有很多。因此，要不断探索影响检验结果的因素，加强实施实验室的内部质量控制，持续改进，为微生物检验实验室结果的可靠性和准确性提供依据，为提高药品质量控制和监管提供支持。
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（收稿日期：2017-04-09）